A DNS-szekvenálás szintén függ attól, hogy képes-e gélelektroforézist használni olyan DNS-szálak szétválasztására, amelyek nagyságrendileg különböznek egy bázispárral.
DNS-szekvenálás
Az 1970-es évek végén két DNS-szekvenálási technikát találtak hosszabb DNS-molekulákra. Ezek voltak a Sanger (vagy dideoxy) módszer és a Maxam-Gilbert (kémiai hasítás) módszer. A Maxam-Gilbert-módszer nukleotid-specifikus hasításon alapul, és leginkább oligonukleotidok szekvenálására alkalmazható (rövid nukleotid polimerek, általában 50 bázispár hosszúságúak). A Sanger módszert gyakrabban használják, mert technikailag könnyebben alkalmazható, és a PCR megjelenésével és a technika automatizálásával könnyedén alkalmazható a DNS hosszabb szálaira, beleértve néhány teljes gént is. Ez a technika a dideoxinukleotidok láncvégződésén alapul, a PCR megnyúlási reakciók során.
Sanger módszer
A Sanger-módszerben az analizálandó DNS-szálat templátként alkalmazzuk, és DNS polimerázt alkalmazunk PCR-reakcióban, hogy a primerek alkalmazásával további szálakat állítsunk elő.
Négy különböző PCR reakcióelegyet állítunk elő, amelyek mindegyike egy bizonyos százalékos dideoxinukleozid-trifoszfát (ddNTP) analógot tartalmaz a négy nukleotid egyikéhez (ATP, CTP, GTP vagy TTP). Az új DNS-szál szintézise addig folytatódik, amíg ezen analógok egyikét be nem építjük, amikor is a szál idő előtt csonka.
Mindegyik PCR-reakció végül különböző hosszúságú DNS-szálak keverékét tartalmazza, amelyek mindegyike a nukleoziddal végződik, amely dideoxi-jelzést kapott erre a reakcióra. A gélelektroforézist ezután négy különálló sávban elkülönítjük a négy reakciószakasz szálát, és meghatározzuk az eredeti sablon szekvenciáját, attól függően, hogy milyen hosszúságú szálak végződnek a nukleotiddal.
Az automatizált Sanger reakcióban olyan primereket alkalmaznak, amelyek négy különböző színű fluoreszkáló címkével vannak jelölve. A különböző didezoxi-nukleotidok jelenlétében a PCR-reakciókat a fent leírt módon hajtjuk végre. Ezután azonban a négy reakcióelegyet egyesítjük és egy gél egyetlen sávjára alkalmazzuk. Az egyes fragmensek színét lézersugárral detektáljuk, és az információt olyan számítógép segítségével gyűjtjük össze, amely kromatogramokat állít elő, amelyek minden színhez csúcsokat mutatnak, és amelyekből a templát DNS-szekvenciáját meghatározhatjuk.
Tipikusan az automatizált szekvenálási eljárás csak a legfeljebb 700-800 bázispár hosszúságú szekvenciákra pontos. Azonban lehetséges a nagyobb gének, sőt az egész genomok teljes szekvenciáinak előállítása step-wise módszerek alkalmazásával, mint pl. Primer Walking és Shotgun szekvenálás.
A Primer Walking- ban egy nagyobb gén működőképes részét szekvenáljuk a Sanger-módszerrel. Új szekvenciákat állítunk elő a szekvencia megbízható szekvenciájából, és felhasználjuk a gén azon részének szekvenálására, amely az eredeti reakciók tartományán kívül esik.
A lövedék-szekvenálás során véletlenszerűen vágják el a kérdéses DNS-szegmenset megfelelőbb (kezelhető) méretű fragmensekké, szétválasztják az egyes fragmentumokat, és átrendezik a darabokat az átfedő szekvenciák alapján. Ezt a technikát könnyebbé tette a számítógépes szoftverek alkalmazása az átfedő darabok rendezésére.