Az 1983-ban kifejlesztett PCR eljárás lehetővé tette a DNS szekvenálásának elvégzését és azonosítja a nukleotidok sorrendjét az egyes génekben.
Az eljárás során hőcserét vagy a reakció ismételt melegítését és hűtését alkalmazzuk a DNS olvadására és replikációjára. A PCR folytatásaként az "új" DNS-t templátként alkalmazzuk a replikációhoz, és láncreakció következik be, exponenciálisan amplifikálva a DNS-templátot.
A biotechnológia számos területén alkalmazzák a PCR-technikákat, ideértve a protein-mérnököket , a klónozást, a kriminalisztika (DNS-ujjlenyomat), az apasági vizsgálatok, az örökletes és / vagy fertőző betegségek diagnózisát, valamint a környezeti minták elemzését.
A kriminalisztika területén különösen a PCR különösen hasznos, mert még a legkisebb mennyiségű DNS bizonyítékot is felerősíti. A PCR is felhasználható a több ezer éves DNS elemzésére, és ezeket a technikákat a 800.000 éves mamutról a világ minden tájáról származó múmiákra történő azonosítására használták fel.
PCR eljárás a következő:
- Inicializálás: Ez a lépés csak olyan DNS-polimerázokhoz szükséges, amelyek forró indítású PCR-t igényelnek. A reakcióelegyet 94 és 96 ° C közötti hőmérsékletre melegítjük, és 1-9 percig tartjuk.
- Denaturáció: Ha az eljárás nem igényli az inicializálást, a denaturáció az első lépés. A reakcióelegyet 94-98 ° C-ra melegítjük 20-30 másodpercig. A DNS-templát hidrogénkötései megszakadnak, és egyszálú DNS-molekulák jönnek létre.
- Széntelenítés: A reakcióhőmérséklet 50-65 ° C közötti, és 20-40 másodpercig tart. A láncindítók az egyszálú DNS-templáthoz kapcsolódnak. A hőmérséklet ebben a lépésben rendkívül fontos. Ha túl forró, a primer nem kötődik meg. Ha túl hideg, akkor a primer tökéletesen illeszkedik. Jó kötés keletkezik, amikor a primer szekvencia szorosan illeszkedik a sablonszekvenciához.
- Hosszabbítás / nyúlás: A hőmérséklet ebben a lépésben a polimeráz típusától függ. A DNS-polimeráz teljesen új DNS-szálat szintetizál.
- Végső nyúlás: Ezt a lépést a végső PCR ciklus után 5-15 percig 70-74 ° C-on végezzük.
- Végleges tartás: Ez a lépés opcionális. A hőmérsékletet 4-15 ° C-on tartjuk és a reakcióelegyet bevonjuk.
Az eljárás három szakaszra oszlik:
- Exponenciális amplifikáció: Minden ciklus alatt megduplázódik a termék (a replikálandó DNS egy része).
- Kiegyenlítő szakasz: Mivel a DNS-polimeráz elveszti az aktivitást és reagenseket fogyaszt, a reakció lelassul.
- Talaj: Nincs több termék felhalmozódni.