Milyen PCR-nek van köze a DNS-szekvenáláshoz és a gének amplifikálásához
A polimeráz láncreakció ( PCR ) molekuláris genetikai technika egy gén többszörös másolatainak előállításához, és része a génszekvenálás folyamatának.
Hogyan működik a polimeráz-láncreakció?
A génmásolatok DNS-minta felhasználásával készülnek, és a technológia elég jó ahhoz, hogy több példányt készítsen a mintában található gén egy példányából. A gén PCR amplifikálása több millió példány elkészítéséhez lehetővé teszi a génszekvenciák kimutatását és azonosítását vizuális technikák alkalmazásával, a DNS darab méretének és töltésének megfelelően (+ vagy -).
Kontrollos körülmények között a DNS kis részeit DNS-polimerázokkal ismert enzimek generálják, amelyek további dezoxinukleotidokat (dNTP-ket) adnak hozzá a "templátként" ismert DNS-nek. A polimeráz kiindulási pontjaként még kisebb DNS-részeket is, amelyeket "primereknek" neveznek. A primerek kicsi, ember által készített DNS-darabok (oligomerek), általában 15 és 30 nukleotid hosszúak. Ezeket úgy állítják elő, hogy rövid DNS-szekvenciákat ismerünk vagy kitalálunk az amplifikálandó gén legvégén. A PCR során a szekvenált DNS-t felmelegítjük és a kettős szálakat elválasztjuk. Hűtés közben a primerek kötődnek a sablonhoz (úgynevezett hőkezeléssel), és létrehoznak egy helyet a polimeráz kezdetéhez.
A PCR technika
A polimeráz láncreakciót (PCR) a termofilek és a termofil polimeráz enzimek (olyan enzimek felfedezésével lehetett megvalósítani, amelyek magas hőmérsékleten melegítik a szerkezeti integritást és a funkcionalitást).
A PCR technika lépései a következők:
- A keverék létrehozása a DNS-templát, a polimeráz enzim, a primerek és a dNTP-k optimális koncentrációival történik. A keveréknek az enzim denaturálódása nélkül történő melegítésének képessége lehetővé teszi a DNS minta kettős hélixének denaturálását 94 ° C-os hőmérsékleten.
- A denaturálást követően a mintát enyhébb tartományba, körülbelül 54 ° C-ra hűtjük, ami elősegíti a láncindítóknak az egyszálú DNS-templátokhoz történő hevítését (kötődését).
- A ciklus harmadik lépésében a mintát 72 fokosra felmelegítjük, a Taq DNS-polimeráz ideális hőmérséklete a megnyújtás érdekében. A nyúlás során a DNS polimeráz az eredeti egyszálú DNS-t templátként alkalmazza, hogy komplementer dNTP-ket adjon hozzá az egyes primerek 3'-végéhez, és egy kettős szálú DNS-szekciót hoz létre a kérdéses gén régiójában.
- Azok a primerek, amelyek nem egyeznek pontos DNS-szekvenciákkal, 72 ° C-on nem égnek, ezáltal korlátozva a megnyújtást a kérdéses génre.
Ezt a denaturálási, anneálási és nyúlási folyamatot többszörös (30-40) alkalommal ismételjük meg, ezzel exponenciálisan növelve a kívánt gén másolatait a keverékben. Bár ez a folyamat eléggé unalmas lenne, ha manuálisan végrehajtanák, mintákat készíthetünk és inkubálhatunk egy programozható Thermocyclerben, ami most a legtöbb molekuláris laboratóriumban általános, és 3-4 óra alatt teljes PCR reakciót lehet végezni.
Mindegyik denaturáló lépés megállítja az előző ciklus megnyúlási folyamatát, ezáltal lecsökkenti a DNS új szálát, és körülbelül a kívánt gén méretéhez tartja.
A megnyújtási ciklus időtartama hosszabb vagy rövidebb lehet a kérdéses gén nagyságától függően, de végső soron a PCR ismételt ciklusai révén a sablonok többsége a csak érdeklődésre számot tartó gén nagyságára korlátozódik. mindkét láncindító termékből származik.
Számos különböző tényező van a sikeres PCR-hez , amely manipulálható az eredmények javítása érdekében. A PCR-termék jelenlétének leggyakrabban alkalmazott módszere az agaróz gélelektroforézis . A DNS-fragmensek mérete és töltése alapján különíthetők el. A fragmenseket ezután színezékekkel vagy radioizotópokkal mutatják ki.
Az evolúció
A PCR felfedezése óta az eredeti Taq-tól eltérő DNS-polimerázokat fedeztek fel. Ezek közül némelyek jobb "lektorálási" képességgel rendelkeznek, vagy magasabb hőmérsékleten stabilabbak, ezáltal javítva a PCR specifitását és csökkentve a helytelen dNTP beiktatásával járó hibákat.
A PCR egyes változatait speciális alkalmazásokhoz tervezték és rendszeresen alkalmazzák molekuláris genetikai laboratóriumokban. Ezek közül néhány valós idejű PCR és reverz transzkriptáz PCR. A PCR felfedezése a DNS-szekvenálás, a DNS-ujjlenyomat-készítés és más molekuláris technikák kifejlesztéséhez is vezet.