A polimeráz-láncreakció (PCR) bármelyik összetevőjének módosítása megváltoztathatja az eredmény minőségét, vagy a termék hozamának és minőségének javításával vagy csökkenésével, vagy a reakcióspecifitás és érzékenység javításával. A végeredményt befolyásoló paraméterek lehetnek fizikai (pl. Hőmérséklet, ciklusidő) vagy kémiai (pl. Sablon koncentráció, az alkalmazott enzim típus). A következőkben számos fontos tényező befolyásolja a PCR sikerét.
01 Tiszta laboratóriumi körülmények
Mivel a PCR képes egyetlen molekula DNS kimutatására, fontos, hogy a laboratóriumban megőrizzék a tiszta állapotokat. Mindig viseljen friss kesztyűt, használjon steril üvegtárgyakat, csöveket és pipettákat és steril oldatokat, és a munka megkezdése előtt tisztítsa meg a munkaterületet.
Mindig tartalmazzon kontrollreakciókat templát DNS nélkül és enzim nélkül, hogy az eredmények valóban a jobb mintázat erősítésének köszönhetőek legyenek.
A legtöbb embernek gondoskodnia kell arról, hogy saját megoldásai vannak, amelyek nincsenek megosztva a hibaelhárítás megkönnyítésével, és a kijelölt pipettákat gyakran csak PCR-re helyezzük el. A DNase és RNase-mentes PCR csövek, az aeroszol-rezisztens pipetták és az UV-sugárzással működő füstelszívó csövek szintén a lehető legkisebbre csökkentik a problémákat.
02 Kémiai komponensek
- Van 18-24 bázis
- Nincs másodlagos szerkezete (azaz hajtű hurkok)
- G / C és A / T pár kiegyensúlyozott eloszlása
- A 3 láb hosszúságúak nem egymásnak kiegészítőek
- Olvadási hőmérséklete (Tm) körülbelül 5-10 ° C-nál alacsonyabb a hőkezelési hőmérséklet alatt, ami rendszerint 55 és 65 Celsius fok közötti
Mindkét láncindító Tm-nek hasonlónak kell lennie a legjobb eredmény eléréséhez.
03 Reakciókeverék: sablon és alapozók
Az optimális alapkoncentráció 0,1 és 0,6 mikromol / l között van. A sablon mennyisége a DNS típusától (humán, bakteriális, plazmid) függően változik.
A nagyon kis mennyiségű sablon mellett más stratégiák is alkalmazhatók az eredmények javítására, például a megnövelt ciklusszámok vagy a "forró indítás" használatára. Mindig ellenőrizze az új primereket pozitív kontrollreakcióval, hogy biztos legyen abban, hogy az adott kísérleti körülmények között dolgozik.
04 reakciókeverék: enzimaktivitás
Az MgCl2 koncentrációja a reakcióelegyben befolyásolhatja a PCR eredményét, és fontos szerepet játszhat a gyorsabb reakciókban. A magnézium-kation oldható komplexeket képez a dNTP-kkel annak érdekében, hogy a polimeráz enzim által felismert tényleges szubsztrátot létrehozza.
A négy dNTP egyenlő mennyisége szintén csökkenti a polimeráz-hibaarányt. Bizonyos adalékanyagok, mint a betain, BSA, detergensek, DMSO, glicerin és pirofoszfatáz szintén befolyásolhatják az enzim specifitását vagy a reakció hatékonyságát.
05 A hermocycler típusa
A laboratóriumi felszerelések vásárlásakor vegye figyelembe, hogy néhány termocikler kevésbé pontos, mint mások a pontos, kívánt hőmérséklet fenntartására.
Ez az egyik olyan terület, ahol az olcsó megfizetés hosszú távon nem fizet ki, ha szeszélyes reakcióval vagy olyan alapozókkal szembesülsz, amelyek szűk körű hőkezelési hőmérsékletet igényelnek.
A vékony falú reakciócsövek a pontos termocikler márkához illeszkednek, és segítenek optimalizálni a reakcióhőmérsékletet.
06 Ciklus beállítások
A megnövekedett hozam elérhetõ úgy, hogy a meghosszabbítási idõt minden 20 ciklusban megnöveljük, hogy kisebb mennyiségû enzimet kompenzáljunk. Általában kevesebb, mint 40 ciklus elég ahhoz, hogy 10-nél kevesebb templátmolekulát erősítsünk olyan koncentrációig, amely elég nagy ahhoz, hogy egy etidium-bromiddal festett agarózgélen nézzen.