A gén-klónozás az egyetlen gén másolatainak vagy klónjainak előállítása. Miután egy gént azonosítottunk, a klónok felhasználhatók az orvosbiológiai és az ipari kutatások számos területén. A géntechnika a gének új organizmusokba történő klónozásának folyamata vagy a DNS-szekvencia megváltoztatása a fehérjetermék megváltoztatására. A géntechnológia attól függ, hogy képesek-e a következő lényeges eljárások végrehajtására.
01 Polimeráz láncreakció
02 restrikciós enzimek
A restrikciós endonukleázként ismert enzimek feltárása alapvető fontosságú a fehérje-technikához . Ezek az enzimek a nukleotidszekvencián alapuló specifikus helyeken DNS-t vágnak. Különböző különböző restrikciós enzimeket , amelyek alkalmasak arra, hogy egy különálló helyre vágják a DNS-t, számos különböző baktériumtörzsből izoláltak. A restrikciós enzimmel elválasztott DNS sok kisebb méretű, kisebb méretű fragmenst termel. Ezeket gélelektroforézissel vagy kromatográfiával különíthetjük el.
03 Elektroforézis
A sejttenyészet DNS-ből történő tisztítása, vagy restrikciós enzimekkel történő levágás nem lenne sok hasznuk, ha nem tudtuk megjeleníteni a DNS-t, vagyis megtaláljuk a módját annak megítélésére, hogy a kivonat tartalmaz-e valamit, vagy milyen méretű fragmenteket tartalmaz Megcsináltam. Ennek egyik módja a gélelektroforézis. A géleket különféle célokra használják, a DNS-betétek és a knockoutok kimutatására szolgáló vágott DNS-t.
04 Csatlakozzon két darab DNS-hez
A genetikai kutatások során gyakran szükség van két vagy több egyedi DNS-szál összekapcsolására rekombináns szál létrehozására, vagy egy restrikciós enzimekkel vágott kör alakú szál lezárására. A DNS-ligázoknak nevezett enzimek kovalens kötéseket hozhatnak létre a nukleotidláncok között. Az enzimek DNS polimeráz I és polinukleotid kináz ebben a folyamatban is fontosak a rések kitöltése vagy az 5 'végek foszforilezése szempontjából.
05 A kis önreplikáló DNS kiválasztása
A kis körkörös DNS-darabok, amelyek nem részei a bakteriális genomnak, de képesek az önreplikációra, plazmidként ismertek. A plazmidokat gyakran használják vektorokként a mikroorganizmusok génjeinek transzportálására. A biotechnológiában, amint a kérdéses gént amplifikálták, és mind a gént, mind a plazmidot restrikciós enzimekkel vágják le, azokat összeolvasztják, és így létrehozzák a rekombináns DNS-t. A vírus (bakteriofág) DNS vektorként is használható, akárcsak kozmidok, bakteriofággéneket tartalmazó rekombináns plazmidok.
06 Mód a vektor mozgatására a gazdasejtben
A genetikai anyag vektorba, például plazmidba való átvitelének folyamatát új gazdasejtekké nevezzük transzformációnak. Ez a technika azt követeli meg, hogy a gazdasejtek környezeti változásnak legyenek kitéve, ami "véve alkalmasnak", vagy ideiglenesen áteresztővé teszi a vektort. Az elektroporáció egy ilyen technika. Minél nagyobb a plazmid, annál kisebb a hatékonyság, amellyel a sejtek felveszik. A nagyobb DNS-szegmenseket könnyebben klónozzák bakteriofág, retrovírus vagy más vírusvektorok vagy kozmidok alkalmazásával transzdukcióban. A fág- vagy vírusvektorokat gyakran használják a regeneratív gyógyászatban, de a DNS-t a kromoszómák egyes részeibe inszertálhatják, ahol nem akarjuk, komplikációkat, sőt rákot is okozva.
07 A transzgenikus organizmusok kiválasztásának módszerei
Az átalakulás során nem minden sejt veszi fel a DNS-t. Létfontosságú, hogy legyen olyan módszer, amely észleli azokat. Általában a plazmidok génjei az antibiotikum rezisztenciára és a transzgenikus sejtekre választhatók ki az említett gének expressziója és az ilyen antibiotikumot tartalmazó táptalajon való növekedési képességük alapján. Az alternatív szelekciós eljárások más riporterfehérjék, például az x-gal / lacZ rendszer vagy a zöld fluoreszcencia fehérje jelenlététől függenek, amelyek lehetővé teszik a színes és fluoreszcencia alapján történő szelekciót.