Hogy állnak ezek az endonuceleases
Mennyit tud a restrikciós enzimről? Ismerje meg, mit csinálnak, és miért fontosak, ezzel a felülvizsgálattal.
A restrikciós enzimek meghatározása
A restrikciós endonukleázok egy olyan enzimkategória, amely DNS-molekulákat vág. Minden egyes enzim egyedi nukleotidszekvenciát ismernek fel a DNS-szálban. Az ilyen szekvenciák általában 4-6 bázispár hosszúak. A szekvenciák palindromikusak abban az értelemben, hogy a komplementer DNS-szál ugyanaz a szekvenciája csak fordított irányban van.
Más szóval, mindkét DNS-szálat ugyanazon a helyen vágják le.
Hol találhatók ezek az enzimek
A restrikciós enzimeket számos különböző baktériumtörzsben találjuk, ahol biológiai szerepe van a sejtvédelemben. Ezek az enzimek "korlátozzák" a sejtbe belépő idegen (pl. Vírus) DNS-t, megsemmisítve azt. A gazdasejtnek olyan restrikciós módosító rendszere van, amely metilátja saját DNS-ét a megfelelő restrikciós enzimekre specifikus helyeken, ezáltal megvédi a hasadástól. Több mint 800 ismert enzimről számoltak be, amelyek több mint 100 különböző nukleotidszekvenciát ismertek fel.
Használat a biotechnológiában
A biotechnológiában a restrikciós enzimeket alkalmazzuk, hogy a DNS-t kisebb szálakká vágjuk, hogy megfigyeljük a fragmentumhossz-különbségeket az egyének között (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP). Gént klónoznak is.
RFLP technikákat alkalmaztak annak megállapítására, hogy az egyének vagy az egyének csoportjai megkülönböztető különbségek vannak a génszekvenciákban és a restrikciós hasítási mintákban a genom bizonyos területein.
Ezen egyedi területek ismerete a DNS-ujjlenyomat alapja. Mindegyik eljárás az agaróz gélelektroforézis használatától függ a DNS-fragmensek elválasztására. A TBE-puffert, amely Tris-bázisból, bórsavból és EDTA-ból áll, általában agaróz gélelektroforézisre használják a DNS-termékek vizsgálatára.
A restrikciós enzim típusai
Három különböző típusú restrikciós enzim létezik. Az I típus véletlenszerű helyeken vágja el a DNS-t 1000 vagy több bázispárról az elismerési helyről. A III. Típusú darab körülbelül 25 bázispárral vágja le a helyszínt. Az I. és a III. Típusok ATP-t igényelnek, és lehetnek nagyobb enzimek több alegységgel. A II. Típusú enzimek, amelyeket elsősorban a biotechnológiában használnak, a DNS-t az elismert szekvencián belül vágják le anélkül, hogy ATP-re lenne szükségük, és kisebbek és egyszerűbbek.
A II. Típusú restrikciós enzimeket azon baktériumfajok alapján nevezik el, amelyekből izoláltak. Például az EcoRI enzimet E. coli- ból izoláltuk. A lakosság nagy része ismeri az E. coli kitörését az élelmiszerekben.
A II. Típusú restrikciós enzimek két különböző típusú vágást generálhatnak attól függően, hogy mindkét szálat a felismerési szekvencia középpontjában levágják-e, vagy mindegyik szál közelebb van-e az elismerési szekvencia egyik végéhez.
Az előbbi vágás "tompa véget" eredményez, nincs nukleotid túlnyúlás. Az utóbbi "ragacsos" vagy "kohéziós" végeket hoz létre, mivel a DNS minden egyes fragmensének olyan felülete van, amely a többi fragmentumot üdvözli. Mindkettő hasznos a molekuláris genetikában rekombináns DNS és fehérjék készítéséhez.
Ez a DNS-forma kiemelkedik, mert két vagy több különböző, nem eredetileg összekapcsolt szál kötődésével (kötődésével) állítják elő.