A fehérje tisztaságának mértéke a fehérje szándékolt végfelhasználásától függ.
Egyes alkalmazásokhoz nyers kivonat elegendő. Más alkalmazásokhoz, például élelmiszerekhez és gyógyszerekhez nagy tisztaság szükséges. Ennek eléréséhez számos fehérje tisztítási eljárást alkalmaznak, egy sor tisztítási lépésben.
Mindegyik fehérje tisztítási lépés általában bizonyos mértékű termékvesztést eredményez. Ezért ideális fehérje-tisztítási stratégia az, amelyben a legmagasabb tisztítási szintet érik el a legkevesebb lépésben. A felhasználandó lépések kiválasztása a célfehérje méretétől, töltésétől, oldékonyságától és egyéb tulajdonságaitól függ. A következő technikák a legalkalmasabbak egyetlen citoszolikus fehérje tisztítására. A citoszol protein komplexek tisztítása bonyolultabb, és rendszerint különböző módszerek alkalmazását igényli.
Az első lépések a fehérjetisztításhoz
Az intracelluláris (a sejten belüli) fehérjék tisztításának első lépése egy nyers kivonat készítése .
Az extraktum tartalmazza a sejtcitoplazmából származó fehérjék komplex elegyét, valamint néhány további makromolekulát, kofaktort és tápanyagot. A nyers kivonatot felhasználhatjuk bizonyos alkalmazásokhoz a biotechnológiában, azonban ha a tisztaság kérdése, a következő tisztítási lépéseket kell követni.
A nyers protein extraktumokat a celluláris törmelék eltávolításával állítják elő, melyet a sejtek lízisével állítanak elő, melyet kemikáliákkal és enzimekkel , ultrahanggal vagy egy francia présszel kapnak. A törmeléket centrifugálással eltávolítjuk, és a felülúszót visszanyerjük. Az extracelluláris fehérjék nyers készítményei úgy nyerhetők, hogy a sejteket egyszerűen eltávolítjuk centrifugálással.
Bizonyos biotechnológiai alkalmazások esetében igény van termostabil enzimekre : olyan enzimek, amelyek denaturálódás nélkül tolerálhatják a magas hőmérsékletet, valamint magas specifikus aktivitás fenntartása mellett. A termelõ szervezeteket néha extremofileknek nevezik. A hőálló fehérje megtisztításának könnyű megközelítése a keverékben található egyéb fehérjék denaturálása melegítéssel, majd az oldat hűtésével (így lehetővé teszi a termostabil enzim reformálódását vagy újraoldódását, ha szükséges, majd a denaturált fehérjéket centrifugálással eltávolíthatjuk.
Közbenső tisztítási lépések
A múltban a nyers kivonatból egy fehérje megtisztításának egy közös második lépése a nagy ozmotikus szilárdságú oldat (azaz sóoldatok) kicsapása volt. A nyers kivonatban lévő nukleinsavak eltávolíthatók sztreptomicin-szulfáttal vagy protamin-szulfáttal képzett aggregátumok kicsapásával.
A fehérje kicsapódását általában sóként ammónium-szulfát alkalmazásával végezzük.
Különböző fehérjék csapódnak le az ammónium-szulfát különböző koncentrációiban. Általában a magasabb molekulatömegű fehérjék alacsonyabb ammónium-szulfátkoncentrációban csapódnak le. A sóképzés általában nem vezet nagy tisztaságú fehérjéhez, de segíti a nem kívánt fehérjék eltávolítását a keverékben, és koncentrálja a mintát. Az oldatban lévő sókat ezután dializáljuk porózus cellulóz csövön, szűréssel vagy gélkibocsátó kromatográfiával.
A modern biotechnológiai protokollok gyakran kihasználják a sok kereskedelmi forgalomban kapható készletet, amelyek készen állnak a szabványos eljárásokhoz. A fehérjetisztítás gyakran szűrők és gélszűrő oszlopok alkalmazásával történik. Mindössze annyit kell tennie, hogy kövesse az utasításokat, és adja hozzá a helyes oldat megfelelő térfogatát, és várjon az előírt időtartamot az eluáló gyűjtése közben (mi jön ki az oszlop másik végéről) egy friss kémcsőben.
- A kromatográfiás módszereket bench-top oszlopok vagy automatizált HPLC berendezések alkalmazásával lehet alkalmazni. A HPLC-vel történő elválasztást fordított fázisú, ioncserélő vagy méretkizárásos módszerekkel, valamint dióda-tömbvel vagy lézertechnológiával detektált mintákkal lehet elvégezni.
A fehérje vizualizációja és a tisztítás értékelése
- A fordított fázisú kromatográfia (RPC) a fehérjéket relatív hidrofóbicitásuk alapján választja el. Ez a technika nagyon szelektív, de szerves oldószereket igényel. Bizonyos fehérjéket tartósan denaturálják oldószerekkel, és az RPC során a funkcionalitást elveszítik. Ezért ez a módszer nem ajánlott minden alkalmazás esetében, különösen akkor, ha a célfehérje megtartja tevékenységét.
- Az ioncserélő kromatográfia a fehérjék töltésen alapuló elválasztására utal. Oszlopok állíthatók elő anioncseréhez vagy kationcseréhez. Az anioncserélő oszlopok pozitív töltésű állófázist tartalmaznak, amely negatív töltésű fehérjéket vonz. A kationcserélő oszlopok a fordított, negatív töltésű gyöngyök, amelyek pozitív töltésű fehérjéket vonzanak. A célprotein (ek) eluálását úgy végezzük, hogy a pH-t az oszlopban változtatjuk, ami az egyes fehérjék töltött funkciós csoportjainak változását vagy semlegesítését eredményezi.
- A méretkizárásos kromatográfia ( gélszűrés ) elválasztja a nagyobb fehérjéket a kicsiektől, mivel a nagyobb molekulák gyorsabban haladnak a kromatográfiás oszlopon lévő térhálós polimeren keresztül. A nagy fehérjék nem illeszkednek a polimer pórusaiba, míg kisebb fehérjék, és a kromatográfiás oszlopon keresztül tovább tartanak, kevésbé közvetlen útján. Az eluátumot az eluálási idő alapján fehérjéket elválasztó csövekből gyűjtjük össze. A gélszűrés hasznos eszköz a fehérje minta koncentrálására, mivel a célfehérjét kisebb mennyiségű elúciós térfogatban gyűjtik össze, mint amilyet az oszlophoz kezdetben hozzáadtak. Hasonló szűrési technikákat alkalmazhatunk nagy mennyiségű fehérje termelés során költséghatékonyságuk miatt.
- Az affinitási kromatográfia nagyon hasznos technika a "polírozáshoz" vagy a fehérje tisztítási folyamat befejezéséhez. A kromatográfiás oszlop gyöngyeit olyan ligandumokkal térhálósítjuk, amelyek specifikusan kötődnek a célfehérjéhez. A fehérjét ezután eltávolítjuk az oszlopról úgy, hogy a szabad ligandumokat tartalmazó oldattal öblítjük. Ez a módszer a legtisztább eredményeket és a legmagasabb specifikus aktivitást adja a többi technikához képest.
- Az SDS-PAGE egy poliakrilamid gélelektroforézis, amelyet SDS (nátrium-dodecil-szulfát) jelenlétében hajtanak végre, amely a fehérjékhez kötődik, így nagy nettó negatív töltést biztosít. Mivel a fehérjék veszteségei viszonylag egyenlők, ez a módszer szinte teljesen a méret alapján szétválasztja őket. Az SDS-PAGE-t gyakran alkalmazzák a fehérje tisztaságának tesztelésére egy sorozat minden lépése után. Mivel a nemkívánatos fehérjék fokozatosan eltávolításra kerülnek a keverékből, az SDS-PAGE gélen megjelenített sávok száma csökken, míg csak egy sáv van, amely a kívánt fehérjét képviseli.
- Az immunoblotting egy fehérje-vizualizációs technika, amelyet az affinitáskromatográfiával kombinálva alkalmaznak. Egy specifikus fehérje elleni antitesteket ligandumokként használnak affinitáskromatográfiás oszlopon. A megcélzott fehérjét megtartjuk az oszlopon, majd az oszlopot sóoldattal vagy más szerekkel öblítjük. A radioaktív vagy festékcímkékhez kapcsolódó antitestek segítenek a célfehérje kimutatásában, miután elválasztják a keverék többi részétől.
Forrás:
Zubay G. 1988. Biochemistry, 2. kiadás. Macmillan Publishing Co., New York, NY, USA.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Protein Purification Handbook, Edition AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc. New Jersey, Amerikai Egyesült Államok. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.